【破解50年謎題,關乎2/3癌症:北大孔道春實驗室揭示DNA複製叉穩定機制】人類約2/3的癌症發生被認為是由DNA複製錯誤導致。在正常細胞生長過程中,基因組不穩定主要來自DNA複製錯誤。過去 50 年來,停頓DNA複製叉不穩定並傾向於垮塌的原因是困擾生命科學界的核心謎題之一。

2021年6月10日,北京大學生命科學學院教授孔道春實驗室在美國《國家科學院院刊》在線發表論文http://t.cn/A6V3y8zA ,回答了DNA複製叉傾向於垮塌的原因,並揭示了細胞周期檢驗點(checkpoint)調控維持停頓複製叉穩定的核心分子機制。

▲ 解開50年謎題

“DNA複製錯誤主要來自DNA複製叉的不穩定。”孔道春對《中國科學報》說,“揭示checkpoint調控維持停頓複製叉穩定的核心分子機制,找到DNA複製叉不穩定的原因,人們就可以有的放矢,在疾病篩查、靶向藥物開發方面做很多工作。甚至可以在增強DNA穩定性方面有所作為,如果能讓DNA複製叉更穩定,就有可能延長人類(包括其他生命體)的壽命。”

孔道春解釋說,DNA複製叉主要由兩部分構成,Y字型的DNA結構和DNA複製體。DNA複製體包含一系列與複製相關的蛋白質及蛋白質複合物,其中,最重要的是打開雙鏈DNA模板的CMG解旋酶複合物,以及進行新生鏈DNA合成的DNA聚合酶。

“生命科學領域有很多待解謎題,而細胞周期檢驗點調控維持停頓複製叉穩定機制,是該領域的核心謎題之一。”孔道春說,“正常移動的DNA複製叉是相對穩定的,DNA複製體中的CMG解旋酶與DNA聚合酶在物理及生化功能上緊密偶聯。當DNA複製叉遭遇複製障礙停頓下來時,停頓的DNA複製叉被證明是不穩定的,傾向於垮塌。”

▲ 拉開機制研究帷幕

上個世紀60年代末,科學家在裂殖酵母里篩選到了一株突變株,命名為rad3-136。很快,研究人員發現,rad3-136突變株對羥基脲 (HU抑制dNTPs合成,導致DNA複製叉停頓)高度敏感。至此,真核細胞維持停頓DNA複製叉穩定的機制研究拉開了序幕。

1988年,Rad3及相關蛋白介導的細胞調控被科學家命名為checkpoint調控,Rad3被歸類為ATR激酶。

過去50年,前後上千個實驗室,用兩代人的時間,發表了上萬篇研究文章,證明checkpoint是維持停頓DNA複製叉穩定的必需細胞調控。在checkpoint缺失或缺陷的細胞,停頓的DNA複製叉發生垮塌,導致DNA複製不能完成,及基因組的極度不穩定。

但在試圖闡明checkpoint調控維持DNA複製叉穩定的機制研究方面,科學家碰到了極大阻力。阻力主要來自於checkpoint調控的靶蛋白極難被確定,已發表文章的結論也互相矛盾,導致checkpoint調控維持DNA複製叉穩定的核心機制長期難以確定。

▲ 闡明核心機制

通過大規模的遺傳篩選,孔道春實驗室發現,複製解旋酶CMG複合體的一個亞基Cdc45的突變,能極大降低(600~3000倍)checkpoint通路缺陷細胞對HU的敏感性。

“這暗示Cdc45或CMG複合體可能被checkpoint調控。”孔道春說,“通過一系列遺傳及生化分析,我們發現DNA複製叉停頓後,Cds1Chk2同時磷酸化Cdc45亞基上的三個絲氨酸殘基。這三個絲氨酸殘基的磷酸化導致CMG複製解旋酶活性深度降低。CMG複製解旋酶活性的降低使得它不能脫離停頓複製叉,不能與被阻擋的DNA聚合酶分開。這樣,停頓的DNA複製體及複製叉的生化完整性得到了維持,從而阻止了停頓DNA複製叉的垮塌。”

“停頓DNA複製叉里的複製解旋酶與DNA聚合酶傾向於分開關聯到兩件事情,一是DNA複製體或DNA複製叉的基本生化特性;二是正常細胞生長過程中導致複製叉停頓的基本原因。” 該論文共同第一作者劉陽告訴《中國科學報》,“DNA二級結構導致的複製叉停頓是一個經常發生的生物事件。在前導鏈或後隨鏈的DNA模板上,如果有鹼基損傷(每個人細胞每天有約105級別的這類損傷)或化學修飾,也會阻擋DNA聚合酶並導致複製叉停頓。當DNA聚合酶被阻擋後,CMG解旋酶還要往前移動,這樣就會導致CMG解旋酶與DNA聚合酶物理上的分開,導致複製叉垮塌。”

經過不懈努力,checkpoint調控維持停頓DNA複製叉穩定的核心機制最終得以闡明。即,停頓複製叉不穩定、傾向於垮塌的根本原因是當DNA聚合酶被阻擋後,複製解旋酶與DNA聚合酶傾向於分開。同時checkpoint調控維持停頓複製叉穩定的核心機制是:降低複製解旋酶的活性,阻止複製解旋酶脫離複製叉或DNA聚合酶,維持兩者之間在物理及生化功能上的緊密偶聯,從而維持停頓複製叉穩定,並保持它的生物學功能。

“找到問題,找出問題的原因,往往離解決問題就不遠了,希望這些研究能讓人們離戰勝癌症等重大疾病更近一些。”孔道春說。http://t.cn/A6V3y8zw

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