【地毯式篩選:引導編輯實現水稻定向進化】一年多以前,可實現基因組所有12種單鹼基自由轉換的引導編輯技術誕生。6月10日,中國科學家在《自然—植物》發表最新研究成果http://t.cn/A6VefV0x ,利用引導編輯技術首次在水稻中實現定向進化,並創制了可供育種的新種質。

“我們的工作證明人工進化相對於自然選擇存在一定優勢,這可以讓作物改良的進程大大加快。”論文通訊作者、安徽農業科學院研究員魏鵬程在接受《中國科學報》採訪時說。

中國農業科學院中國水稻研究所研究員王克劍告訴《中國科學報》,相較於CRISPR靶向突變和單鹼基編輯技術,引導編輯技術提供了關鍵功能位點的人工進化新方法。

▲ 窮盡64種組合,實現飽和突變篩選

基因組中的鹼基有四種。2013年出現的基因編輯技術可以實現鹼基之間的轉換。2017年,科學家實現了高效的T轉換為C,A轉換為G。2019年10月又實現了四種鹼基之間的任意轉換,也就是引導編輯技術。

一項新技術在農業領域中走向應用要花多長時間?

一年零8個月,引導編輯技術完成了在哺乳動物中開發成功,在植物中成功建立並優化,在水稻中實現功能位點的全部20種氨基酸編輯並創制新種質。

“早期的基因編輯方法(靶向突變)只能在某一個片段上產生一個突變,但這種突變是什麼樣子的沒有辦法控制。也就是說能控制突變的位置,而不能控制突變的形式。”魏鵬程說,其他傳統理化誘變等技術也無法控制突變的形式。

而且,靶向突變往往插入或者刪掉一個片段,造成的是功能的破壞。“但生產上需要的不是這種功能的破壞,而是把相應位點的功能調高一點或者調低一點,甚至創造新的功能。”魏鵬程說,利用早期的單鹼基編輯技術達不到這個目標。

科學家一直想在一個基因位點上嘗試所有可能的突變形式,也就是試試所有氨基酸會產生什麼樣的表型。

論文第一作者許蓉芳介紹,3個鹼基組成1個氨基酸,而4種鹼基的隨機排列有64種組合,這些組合對應所有20種氨基酸。在他們的研究中,利用引導編輯技術,可以在特定位點上實現所有64種鹼基組合的轉換,即完成單個氨基酸位點的飽和突變。

“體外飽和突變篩選是目前研究蛋白功能的重要手段,但在真核生物體內實現關鍵氨基酸高頻替換,尚存在較大技術難度。”王克劍說,這項研究成功地在水稻中建立了可實現體內特定位點氨基酸飽和替換突變的新型技術策略,可以獲得不同的表型,解決了上述技術難題。

▲ 創制自然界中不存在的新位點

遺傳變異是作物育種基礎。魏鵬程介紹,盡管近年來功能基因組研究為作物分子育種提供了大量主效改良位點/基因;但由於傳統誘變靶向性不足、突變隨機性較大等技術問題,在多數情況下,挖掘和鑒定這些主效基因最適於生產的等位型仍較為困難。

在研究水稻抗除草劑基因的過程中,有很多突變是天然產生的。“但我們不知道這些天然突變是不是最適合的突變。”魏鵬程解釋說,比如,一個突變可以讓水稻具有抗除草劑性狀,但也可能同時造成了生長緩慢,甚至產量下降。

科學家猜測,天然突變可能無法讓一個基因完全發揮優勢。魏鵬程說,通過飽和突變,也就是在某些關鍵位點逐個嘗試不同的氨基酸替換突變,然後測試不同等位型的效果好壞與否,有可能找到最適合某一作物某一位點的突變。

“如何在體內實現重要基因關鍵位點的飽和氨基酸替換突變是該類研究的難點問題。”魏鵬程說。

許蓉芳告訴《中國科學報》,選擇水稻抗除草劑基因OsACC1作為研究對象,主要是基於該基因的功能,OsACC1基因是除草劑關鍵應答基因,它可以通過抗性篩選實驗來分辨不同表型。

通過大量實驗,他們發現抗除草劑基因具有巨大的潛力。許蓉芳介紹,通過在6個已報道的潛在抗性位點上開展方法學研究,他們共發現16種不同類型的氨基酸替換突變可能與除草劑抗性獲得密切相關。其中有3個位點為植物中首次鑒定。

“引導編輯技術具有將目標氨基酸突變為其他19種氨基酸的能力,從而提供了關鍵功能位點的人工進化新方法。”王克劍說,這實際上加快了進化速度。

▲ 人工進化更有優勢

這實際上是一種定向進化。魏鵬程解釋說,定向進化是實驗室中在分子水平的模擬自然進化過程。也就是根據需求,針對目的蛋白人為製造大量的突變並給予選擇壓力,篩選出具有期望特徵的變異型,進而解決生產問題。

“我們篩選到了自然界中不存在的,甚至通過理化誘變和基因編輯也難以創制出來的位點。”魏鵬程說,這證明人工進化方法相對於自然選擇的確存在優勢,也大大拓寬了種質創制的思路。

“研究人員利用這項技術成功篩選到多個水稻抗除草劑的新位點,顯出巨大應用價值。”王克劍說,該研究不僅建立了作物基因定向進化的新方法,也為充分挖掘重要基因新等位型,突破現有種質資源限制,根據生產需求人工“定制”優異性狀提供了新思路,具有重要的借鑒意義。

許蓉芳告訴《中國科學報》,新篩選到的三個位點在目前的實驗中表現出較好的除草劑抗性,後續還要進一步考察其抗除草劑的同時是否能夠保持較好的農藝性狀。

“現有的引導編輯系統的效率還比較低,選擇基因位點時需要其他的一些輔助手段,如抗性篩選等,來減少工作量。隨著引導編輯系統效率的提高,這一方法將可用於更多其他功能基因的定向進化。”許蓉芳說。

相較於其他方法,“通過人工進化,我們篩選到的這些水稻的內源位點,有可能很快就能直接用在生產上,來幫助實現水稻綠色生產模式。”魏鵬程說。他們已經對新發現的基因位點進行了知識產權保護。魏鵬程相信,隨著研究的深入和應用的拓展,未來將有可能應用到農業實踐中。http://t.cn/A6VefV0M

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