【打開糖蛋白激素作用機制“黑匣子”】糖蛋白激素是輔助生殖、治療甲狀腺等疾病的關鍵藥物。近幾十年來,雖然糖蛋白激素臨床應用已經取得很大成功,但它如何激活人體細胞中的受體機制,是長期以來科研人員難以打開的“黑匣子”。

在9月22日發表於《自然》的一項研究中,中國科學院上海藥物研究所(以下簡稱上海藥物所)研究員徐華強、蔣軼、蔣華良等聯合浙江大學教授張岩團隊、北京協和醫院院長張抒揚團隊,打開了這個“黑匣子”。他們首次解析了糖蛋白激素受體,即全長促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(LHCGR)處於失活狀態和多種激活狀態下的4個結構,為糖蛋白激素如何識別與激活其受體提供了詳細的分子機制,有助於臨床開發替代激素治療的小分子藥物。

起底“激活狀態”下的受體結構

糖蛋白激素主要分為兩類。一類是促性腺激素,包括促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和絨毛膜促性腺激素(CG);另一類是促甲狀腺激素(TSH)。激活人體細胞中的受體機制始終未知,極大限制了人們對該類受體的激素選擇性。此外,結構訊息缺乏也制約了靶向該類受體的小分子治療藥物研發。

糖蛋白激素受體結構之所以難解,與其特殊性有密切關系。糖蛋白激素受體為A類G蛋白偶聯受體(GPCR),但與大多數A類GPCR不同,它包含由340~420個氨基酸構成的巨大N端胞外區結構域(ECD)。該結構域由富含亮氨酸的重複序列構成,且存在複雜的糖基化修飾。

徐華強告訴《中國科學報》:“因為結構特殊,糖蛋白激素受體很難重組表達。此外,除了傳統的跨膜區,它還有一個較大的胞外區,也造成其表達非常不穩定。”

體外獲得全長激素受體可謂困難重重。論文第一作者、上海藥物所博士研究生段佳告訴《中國科學報》:“擺在我們面前的第一個難題就是CG配體。一般情況下,我們都是自己表達純化配體,但‘折騰’了兩個月後,發現效果並不理想。”

在一次上網查資料時,她驚喜地發現醫院有現成的CG處方藥,“如果使用處方藥,可能效果會不錯”。後續實驗證明了這一猜想,他們進而解決了CG配體的難題。

但常規方法制備出的蛋白量不僅很少,結果也不穩定。通過查閱文獻,段佳發現,糖蛋白激素受體存在很多點突變,這些突變會引起一系列疾病。為此,她對文獻中涉及的所有突變進行篩選,最後鎖定了能夠使受體持續性激活的突變S277I。“通過引入這一突變,不僅讓受體更加穩定,還提高了受體的表達量。”

在單顆粒冷凍電鏡技術的“加持”下,研究團隊最終解析了3個近原子解析度的全長LHCGR處於激活狀態下的結構,包括結合內源性激素CG的LHCGR(野生型)受體結構(4.3埃)、結合內源性激素CG的LHCGR(含持續性激活突變S277I)受體結構(3.8埃)以及結合內源性激素CG和小分子化合物Org43553的LHCGR(含持續性激活突變S277I)受體結構(3.2埃)。

不能缺位的“失活狀態”

解開激活狀態下的全長LHCGR結構謎團,只是第一步。“很多現象僅靠解析激活狀態下的結構是不夠的。”段佳說,“以往解析GPCR時,都是配體與受體的跨膜區相互作用後,引起跨膜區的構象變化,進而激活受體。但對於糖蛋白激素受體的激活,配體僅僅與受體胞外域相互作用,在沒有接觸到受體跨膜區的情況下,仍然能夠引起跨膜區構象的變化。”

這意味著,只有繼續解析失活狀態下的糖蛋白激素受體結構,才能完整揭示該類受體的激活機制。雖然激活狀態下的解析工作為後續研究奠定了重要基礎,但仍然遇到了很多困難。

“在開展這項研究之前,沒有任何單獨GPCR的冷凍電鏡結構報道。而糖蛋白激素受體非常不穩定,可能純化過程中就降解了。”段佳說。

團隊又嘗試了很多辦法,但效果並不明顯。他們想,也許在純化蛋白過程中加入小分子抑制劑能使蛋白更加穩定。通過這種方式,團隊克服了全長失活受體構象高度不穩定的技術難題,並通過擴大數據量,最終解析了失活狀態下全長LHCGR的電鏡結構,解析度為3.8埃。

通過對比激活LHCGR結構,團隊發現受體的ECD發生了大約45度偏轉。進一步通過結構分析和功能試驗驗證,他們最終提出了糖蛋白激素受體激活的“推拉”模型。“這是第一個全長單獨GPCR的電鏡結構。”徐華強說。

助攻小分子藥物研發

近年來,小分子藥物研發逐漸表現出巨大優勢,也越來越受到患者和市場的青睞。徐華強表示:“一方面,小分子藥物可以口服,減少了患者身體痛苦和心理負擔;另一方面,小分子藥物可控性和依從性更強,可以做到定時定量。”

為此,研究人員還解析了處於1期臨床試驗中的小分子化合物Org43553與LHCGR相互作用的分子細節,揭示了Org43553的結合口袋,為臨床開發針對LHCGR、FSHR和TSHR的選擇性小分子藥物替代激素治療提供了重要的結構模板。

實際上,國內外對糖蛋白激素的關注由來已久。10年前,徐華強團隊就開始研究糖蛋白激素受體結構,但受限於當時的結構解析技術,研究僅開展兩年便被迫擱置。

兩年前,徐華強團隊聯合合作者重啟該項目。在他看來,研究之所以成功,除了冷凍電鏡技術的進步,還得益於上海藥物所的技術和平台支撐、不同方向團隊的精誠合作。

“糖蛋白激素受體結構解析只是第一步,也是最關鍵的一步。雖然糖蛋白激素作用機制在整個家族是通用的,但與受體之間也存在特異性,仍然需要結構生物學來解答。此外,我們還希望進一步解析FSH和TSH等受體結構,揭示不孕不育、甲亢或甲減等疾病的分子機制,為治療相關疾病藥物的研發提供結構基礎。”徐華強表示。@中科院之聲 http://t.cn/A6M4Am61

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